Pendahuluan
HPLC fase terbalik cukup sederhana. Senyawa-senyawa melekat pada kolom-kolom HPLC fase terbalik dalam fase gerak yang sangat cair dan dielusi dari kolom-kolom HPLC RP dengan fase gerak yang bersifat organik. Pada HPLC RP, senyawa-senyawa dipisahkan berdasarkan karakter hidrofobiknya. Peptida-peptida bisa dipisahkan dengan mengalirkan sebuah gradien linear dari pelarut organik. Biasanya digunakan gradien 60/60 ketika mengkromatografi zat yang tidak diketahui. Gradien 60/60 berarti bahwa gradien bermula pada wujud yang mendekati 100% cair dan meningkat menjadi fasa 60% pelarut organik dalam waktu 60 menit. Kebanyakan peptida (yang panjangnya bisa mencapai 10 hingga 30 residu asam amino) akan terelusi pada saat gradien mencapai fasa 30% organik.
HPLC
dalam kebanyakan kasus, HPLC yang akan digunakan harus mampu memompa dan mencampur dua pelarut. Ini bisa dicapai dengan satu pompa dan sebuah katup penyeimbang atau dengan menggunakan dua pompa terpisah. Pada umumnya, konfigurasi pemompaan merupakan sebuah komponen alat yang diketahui oleh pemakai. Kromatografi fase terbalik juga bisa dilakukan dengan cara yang murni isokratis dimana kondisi-kondisi pelarut dibiarkan konstan, bentuk kromatografi fase terbalik ini bisa dilakukan dengan satu kali pompa. Metode-metode isokratis paling sering digunakan dalam lingkup QC dimana sebuah analit tunggal telah dikarakterisasi secara ekstensif dan senyawa dialirkan untuk menguatkan identitasnya dan untuk mencari produk-produk degradasi yang berhubungan.
Kolom
Pelarut
Pelarut-pelarut HPLC fase terbalik biasanya dipasang pada saluran A dan B dari HPLC. Pelarut A biasanya adalah pelarut cair (air) dan pelarut B biasanya adalah pelarut organik (asetonitril, metanol, propanol). Penting untuk mengikuti kebiasaan ini karena istilah A dan B umum digunakan sebagai pengganti pelarut cair dan pelarut organik, masing-masing. Pelarut A umumnya adalah air berkualitas HPLC dengan 1,% asam. Pelarut B umumnya adalah pelarut organik berkualitas HPLC seperti asetonitril atau metanol dengan 0,1% asam. Asam digunakan untuk memperjelas bentuk puncak pada kromatogram dan untuk menjadi sumber proton dalam LC/MS fase terbalik. Asam yang paling umum digunakan adalah asam formiat, asam triflouroasetat, dan asam asetat. Larutan 0,1% v/v dibuat dengan menambahkan 1 mL asam per liter pelarut. Asam trifluoroasetat telah dilaporkan dapat menekan ionisasi MS dan seringkali operator spektroskopi massa mengurangi persentase TFA menjadi 0,05 atau bahkan 0,02% tanpa keilangan efisiensi kromatografi yang signifikan. Beberapa operator MS menambahkan sedikit asam heptafluorobutirat (HFBA) ke dalam pelarut asam asetat atau pelarut yang mengandung kadar TGA rendah untuk membantu memperjelas bentuk puncak pada kromatogram. Karena spektrometer massa modern sangat sensitif, kita perlu tidak menggunakan ujung-ujung pipet plastik pada saat menambahkan asam ke dalam fase gerak, selalu gunakan pipet kaca. Beberapa sumber mengatakan bahwa pelarut elektrospray yang paling baik adalah metanol 30%, asam asetat 35 mM. Pelarut-pelarut ini umum digunakan untuk infusi, ESI MS, tetapi ada bukti yang menunjukkan bahwa asam asetat lebih rendah kualitasnya untuk membentuk puncak pada kromatogram.
Sistem-Sistem Pelarut untuk ESI LC/MS
Sistem pelarut yang sering digunakan adalah:
A = Air berkualitas HPLC, asam formiat 0,1%
B = Asetonitril berkualitas HPLC, asam formiat 0,1%
Gradient
Pada saat mengkromatografi senyawa yang tidak diketahui biasanya digunaan gradien sederhana berikut untuk mengamati karakter hidrofobik dari senyawa yang tidak diketahui tersebut. Nilai % pelarut A (%A) untuk gradien berikut tidak ditunjukkan secara langsung.
Waktu (menit) %B
0 2
60 60
60,1 2
80 2
Gradien ini disebut gradien 60/60, karena kita memulai dari hampir 0%B sampai 60%B dalam waktu 60 menit. Berdasarkan pengalaman diketahui bahwa 90% dari semua peptida akan terelusi dari sebuah kolom fase terbalik C18 dengan asetonitril 30%. Mungkin ada beberapa peptida yang sangat hidrofobik, yang selanjutnya terelusi sehingga kita mengambil gradien sampai 60%B. Bahkan kita bisa menjalankan gradien ini sampai 80% selama segala sesuatunya belum keluar dari kolom. Mungkin timbul pertanyaan mengapa kita tidak memulai gradien pada 0%B? Seperti yang telah kita sebutkan sebelumnya, pada 0% pelarut organik atau pelarut cair, rantai-rantai alkil C18 yang panjang dan sangat hidrofobik, yang mencoba keluar dari kondisi yang sangat cair, akan mengendap dengan partikel. Pada saat mengendap, rantai-rantai alkil ini tidak efisien lagi dalam menangkap analit sehingga operator kromatografi yang mengetahui hal ini akan memulai dengan gradien yang cukup kecil dari zat organik, 2-5%.
Laju aliran
Penggunaan laju aliran yang tepat untuk kolom HPLC adalah hal yang penting. Berikut ini sebuah tabel dengan laju aliran standar untuk referensi mudah.
Diameter internal (mm)
Laju aliran standar (μl/menit)
4,6
2,1
1,0
0,30
0,15
1000
200
50
4
1
Persiapan Sampel
Sampel biasanya disusun kembali dalam pelarut A untuk memaksimalkan pengikatan pada kolom. Sampel tidak boleh dilarutkan dalam sebuah pelarut organik karena tidak akan melekat pada fase stasioner. Sampel juga tidak boleh dilarutkan dalam larutan yang mengandug deterjen. Beberapa deterjen bisa terikat pada kolom fase terbalik dan memodifikasinya secara reversibel. Disamping itu deterjen terionisasi terlebih dahulu dalam sepektrometri massa elektrospray dan bisa mengganggu pendeteksian atau menekan ionisasi analit.
Mengoptimalkan Pemisahan
Ketika melakukan pemisahan, anda tentu ingin mengoptimalkan hasilnya. Anda mungkin ingin memperdangkal gradien untuk meningkatkan hasil pemisahan, atau anda mungkin ingin mengurangi waktu pengaliran. Dengan ilustrasi (gambar) diatas, seseorang dapat melihat bahwa semua peptida dikeluarkan dari kolom dalam waktu 40 menit. Ini tidak berarti bahwa kita mengubah waktu 80 menit menjadi 40 menit, tetapi ada ruang untuk perbaikan hasil. Tahap pertama dalam pengoptimalan adalah menentukan %B pada mana puncak terakhir terelusi. Jika anda mencermati garis gradien biru (lihat gambar), anda mungkin mengira bahwa puncak terakhir terelusi di dekat 40%B, akan tetapi dugaan ini tidak tepat. Semua sistem HPLC memiliki tundaan gradien. Tundaan gradien adalah waktu antara dimulainya pemompaan pada komposisi fase gerak tertentu dan waktu yang dibutuhkan untuk komposisi pelarut tersebut mencapai kolom dan memiliki sebuah pengaruh. Perkiraan yang baik untuk sebuah tundaan gradien adalah 10 menit. Ini berarti bahwa dugaan kita untuk komposisi fase gerak akhir untuk puncak 40 menit adalah sekitar 30%B. Untuk mengamati waktu tundaan gradien, perhatikan gambar di atas dan amati bahwa baseline kembali ke kondisi awal setelah 70 menit dan bukan pada 60,1 menit ketika pompa telah kembali ke 2%B. Seseorang harus berhati-hati untuk menghindari puncak terakhir terleusi pada “tinggi kesetimbangan”, (pada 70 menit dalam contoh ini). Ini bisa dihindari dengan mengakhiri gradien pada sebuah %B yang sedikit lebih tinggi dari yang diperlukan oleh komponen terakhir.
Berdasarkan pemisahan yang ditunjukkan gambar, seseorang dapat menuliskan ulang gradien sebagai berikut:
Diameter internal (mm)
Laju aliran standar (μl/menit)
0
60
60,1
80
2
30
2
2
Ini akan menjadikan gradien lebih dangkal dan kemungkinan memberikan pemisahan puncak yang lebih baik. Untuk mempersingkat waktu analisis, seseorang bisa menulis ulang gradien sebagai berikut:
Diameter internal (mm)
Laju aliran standar (μl/menit)
0
30
30,1
50
2
30
2
2
Perubahan terakhir ini akan mempersingkat waktu analisis sebesar 30 menit. Waktu analisis yang lebih singkat biasanya lebih baik untuk efisiensi kerja. Setiap menit yang bisa dikurangi dari waktu metode HPLC tanpa mengorbankan tujuan kromatografi akan memberikan efisiensi kerja yang lebih baik. Dengan perubahan ini, puncak terakhir kemungkinan besar masih terelusi pada 40 menit dan pemisahan peptida akan tetap sama seperti pada analisis 60/60 di awal.
Penyeimbangan HPLC
Kolom harus disetimbangkan, disetimbangkan sekali lagi terhadap komposisi pelarut cair awal sebelum analisis lain bisa dilakukan. Biasanya, penyeimbangan ulang ini dilakukan pada akhir gradien. Berapa banyak waktu penyeimbangan yang cukup? Biasanya 20 menit walaupun pada kenyataannya tergantung panjang kolom, laju aliran dan kehidrofoban peptida. Beberapa operator kromatografi menggunakan 10 menit sebagai waktu penyeimbangan standar. Penyeimbangan sebenarnya tergantung pada tujuan. Anda harus menentukan waktu penyeimbangan ini secara eksperimental mengenai kriterianya, apakah analit benar-benar menempel pada kolom dan kromatogram dengan tepat dan tetap dengan analisis selanjutnya.
Pengontrolan Suhu Kolom
Suhu kolom perlu dikontrol. Para ilmuwn adalah orang-orang yang senang mengontrol. Jika anda dapat mengontrol sebuah variabel, maka kontrollah. Sebenarnya jika anda sedang melakukan analisis otomatis selama periode waktu yang lama maka waktu retensi bisa menyimpang akibat suhu lingkungan yang berubah-ubah. Banyak HPLC yang memberikan opsi untuk mengontrol suhu bagian kolom. Jika HPLC yang anda gunakan tidak memiliki komponen seperti ini, sebuah jaket kolom panas bisa digunakan. Suhu kerja yang paling umum adalah 40oC, ini menempatkan bagian kolom tepat di atas suhu lingkungan atau bahkan fluktuasi suhu lingkungan yang paling ekstrim. Disamping mempertahankan suhu konsntan, suhu bisa digunakan untuk mempengaruhi pemisahan kromatografi. Tidak ada analisis kromatografi yang akan lengkap tanpa adanya kajian terhadap suhu. Menurut pengalaman sebagian orang, suhu yang lebih tinggi lebih baik, puncak-puncak akan lebih tajam dan terelusi lebih cepat. Sudah banyak yang melakukan kromatografi pada suhu 60oC dan bahkan ada yang sampai 80oC. Akan tetapi, perlu diingat bahwa suhu yang lebih tinggi akan menyebabkan kolom cepat rusak dan ada beberapa kolom yang tidak bisa mentolerir suhu di atas 60oC. Baca petunjuk alat ketika anda bereksperimen dengan suhu tinggi. Setelah anda melakukan analisis pada suhu tinggi, disarankan agar anda segera mendinginkan dengan meng-off-kan pengatur panasnya karena suhu tinggi dapat menyebabkan kerusakan fase stasioner.
Memulai Analisis Pertama dalam Satu Hari
Pengalaman menunjukkan bahwa jika anda memulai sebuah analisis fase terbalik setelah semalaman alat tidak dinyalakan dengan kolom yang mungkin tetap berada dalam kondisi yang sangat cair selama sampai 10 jam maka analisis akan memberikan hasil yang tidak representatif. Untuk itu diperlukan membilas kolom pertama-tama dengan larutan organik yang akan digunakan selama sekurang-kurangnya 3 volume kolom kemudian mengembalikannya pada kondisi setimbang. Ini akan memberikan kondisi-kondisi kesetimbangan standar secara lebih cepat dan juga akan membersihkan kolom. Alternatif yang lebih baik adalah melakukan analisis pertama kali dengan blanko (atau “analisis persiapan”) dan kemudian analisis selanjutnya bisa berupa analisis yang sebenarnya. Sejumlah orang lebih memilih opsi yang kedua karena kondisi standar bisa diperoleh secara lebih akurat. Akan tetapi, jika dibutuhkan kecepatan, maka opsi pertama bisa dipilih.
Mengakhiri Analisis Terakhir dalam Satu Hari
Kolom biasanya disimpan dalam campuran metanol/air 50/50 tanpa adanya asam. Jika digunakan garam, yang tidak mungkin pada LC/MS, cuci seluruh alat, botol pelarut, HPLC, saluran pelarut, dan kolom, dengan pelarut yang tidak mengandung garam. Garam bisa mengendap dan menyumbat HPLC atau kolom atau bisa menyebabkan korosi. Biasanya kita membilas dengan air murni terlebih dahulu kemudian membiarkan sistem dalam campuran metanol/air 50/50. Beberapa garam bisa mengendap dalam larutan yang sangat organik sehingga pencucian dengan air terlebih dahulu dianjurkan. Larutan metanol:air 50/50 membantu menghentikan pertumbuhan bakteri yang bisa mengotori sistem. HPLC perlu dirawat.
Kromatografi Cair Berkinerja Tinggi (HPLC)
A. Pendahuluan
Kromatografi cair berkinerja tinggi (HPLC) adalah sebuah bentuk kromatografi cair untuk memisahkan senyawa-senyawa yang terlarut dalam larutan. Alat HPLC terdiri dari sebuah waduk fase gerak, sebuah fase stasioner, sebuah pompa, sebuah injektor, sebuah kolom pisah, dan sebuah detektor. Senyawa-senyawa dipisahkan dengan menginjeksikan campuran sampel ke dalam kolom. Komponen-komponen yang berbeda dalam campuran ini melewati kolom dengan kecepatan berbeda-beda akibat perbedaan perilaku penyekatannya antara fase cair (gerak) dan fase stasioner.
B. Instrumentasi
Pada instrumen HPLC, pelarut-pelarut harus dihawagaskan (dihilangkan komponen gasnya) untuk menghalangi pembentukan gelembung-gelembung. Pompa memberikan tekanan tinggi yang tetap tanpa berpulsasi, dan bisa diprogramkan untuk memvariasikan komposisi pelarut selama berlangsungnya pemisahan. Detektor-detektor bergantung pada perubahan indeks refraktif, serapan UV-tampak, atau fluoresensi setelah eksitasi dengan panjang gelombang yang sesuai. Berikut ini adalah skema dari sebuah instrumen HPLC.
Prinsip-prinsip instrumental
Metode: Pemisahan campuran zat dengan karakteristik serapan yang berbeda pada sebuah fase padat.
Aplikasi: penentuan kemurnian zat-zat berbobot molekul rendah, pemisahan campuran-campuran oligomer.
Sampel: pelarut-pelarut dan kinerjanya dalam kromatografi lapis tipis harus diketahui, jumlah sampel yang dibutuhkan sekitar 20 mg.
Aspek keamanan: pengukuran dengan pelarut-pelarut yang sangat toksik tidak mungkin dilakukan.
Teori operasional
Fase gerak
Fase gerak dalam HPLC adalah pelarut yang secara terus menerus dimasukkan ke dalam kolom, atau fase stasioner. Fase gerak berfungsi sebagai pengangkut larutan sampel. Larutan sampel diinjeksikan ke dalam fase gerak melalui sebuah lubang injektor. Pada saat larutan sampel mengalir dalam sebuah kolom bersama-sama dengan fase gerak, komponen-komponen dari larutan ini akan bermigrasi menurut interaksi-interaksi non-kovalen dari senyawa dengan kolom. Interaksi kimia fase gerak dan sampel, dengan kolom, menentukan tingkat migrasi dan pemisahan komponen yang terdapat dalam sampel. Sebagai contoh, sampel-sampel yang memiliki interaksi lebih kuat dengan fase gerak dibanding dengan fase diam akan lebih cepat terelusi dari kolom, sehingga memiliki waktu retensi yang lebih singkat dan sebaliknya. Fase gerak bisa diubah untuk memanipulasi interaksi sampel dan fase stasioner. Ada beberapa jenis fase gerak yaitu: isokratis, gradien, dan polytyptic.
Pada elusi isokratis senyawa-senyawa dielusi dengan menggunakan komposisi fase gerak yang konstan. Semua senyawa mulai bermigrasi dalam kolom pada saat analisis dimulai. Akan tetapi, masing-masing bermigrasi dengan kecepatan berbeda, sehingga ada laju elusi yang cepat dan lambat. Tipe elusi ini sederhana dan tidak mahal, tetapi resolusi beberapa senyawa dipertanyakan dan elusi tidak bisa diperoleh dalam waktu singkat.
Pada elusi gradien, senyawa-senyawa dielusi dengan meningkatkan kekuatan pelarut organik. Sampel diinjeksikan sambil sebuah fase gerak yang lebih lemah diaplikasikan ke dalam sistem. Kekuatan fase gerak selanjutnya ditingkatkan dengan menambah fraksi pelarut organik, yang selanjutnya menghasilkan elusi komponen tertinggal. Ini biasanya dilakukan secara bertahap atau linear.
Fase gerak polytyptic, terkadang disebut sebagai kromatografi mode bercampur, adalah sebuah metode serbaguna dimana beberapa tipe tehnik kromatografi bisa menggunakan kolom yang sama. Kolom-kolom ini mengnadung resin-resin hidrofob makro-pori yang kaku, yang terikat secara kovalen dengan sebuah lapisan organik hidrofil. SEC, IEC, kromatografi hidrofob, atau kromatografi afinitas adalah beberapa metode yang bisa digunakan. Dengan mengubah fase gerak, cara pemisahan berarti dapat diubah sehingga memungkinkan operator kromatografi mencapai selektivitas yang diinginkan dalam pemisahan.
Fase Stasioner
Fase stasioner dalam HPLC adalah pendukung padat yang terdapat dalam kolom yang di dalamnya fase gerak terus mengalir. Larutan sampel diinjeksikan ke dalam fase gerak pengujian melalui lubang injektor. Ketika larutan sampel mengair bersama dengan fase gerak dalam fase stasioner, komponen-komponen larutan tersebut akan bermigrasi menurut interaksi non-kovalen dari senyawa dengan fase stasioner. Interaksi kimia, dari fase stasioner dan sampel dengan fase gerak, menentukan tingkat migrasi dan pemisahan komponen-komponen yang terdapat dalam sampel. Sebagai contoh, sampel-sampel yang memiliki interaksi lebih kuat dengan fase stasioner dibanding dengan fase gerak akan terelusi dari kolom lebih lambat, sehingga memiliki waktu retensi yang lebih lama dan sebaliknya.
Kolom-kolom yang mengandung berbagai jenis fase stasioner telah banyak diperdagangkan. Beberapa fase stasioner yang umum antara lain: Cair-Cair, Padat-Padat (Adsorpsi), Size Exclusion, Fase Normal, Fase Terbalik, Pertukaran Ion, dan Afinitas.
Prinsip kerja Padat-Padat adalah polaritas. Senyawa-senyawa yang memiliki gugus-gugus fungsional yang mampu terikat dengan ikatan hidrogen yang kuat akan menempel lebih kuat ke fase stasioner dibanding senyawa-senyawa yang kurang polar. Sehingga, senyawa-senyawa yang kurang polar akan terelusi dari kolom lebih cepat dibanding senyawa-senyawa yang sangat polar.
Prinsip kerja Cair-Cair sama dengan padat-padat. Akan tetapi, tehnik ini lebih cocok untuk sampel-sampel yang memiliki polaritas sedang yang dapat larut dalam pelarut organik yang sedikit polar sampai yang polar. Pemisahan non-elektrolit dicapai dengan mencocokkan polaritas sampel dan fase stasioner dan dengan menggunakan sebuah fase gerak yang memiliki polaritas yang jauh berbeda.
Prinsip kerja Size-Exclusion didasarkan pada ukuran molekul senyawa yang sedang dianalisis. Fase stasioner terdiri dari butiran-butiran berpori. Senyawa-senyawa yang lebih besar akan dikeluarkan dari bagian interior butiran sehingga akan terelusi pertama kali. Senyawa-senyawa yang lebih kecil akan dibiarkan memasuki butiran-butiran dan akan terelusi menurut kemampuan mereka untuk keluar dari pori-pori berukuran sama dengan tempat sebelumnya. Kolom bisa berbasis silika atau non-silika. Akan tetapi, ada beberapa size-exclusion yang merupakan anionik lemah dan sedikit hidrofobik yang menimbulkan perilaku size-exclusion yang non-ideal.
Prinsip kerja Fase Normal didasarkan pada kehidrofoban dan lifofilitas dengan menggunakan sebuah fase stasioner polar dan sebuah fase gerak yang kurang polar. Sehingga, senyawa-senyawa hidrofob terelusi lebih cepat dibanding senyawa-senyawa hidrofil.
Prinsip kerja Fase Terbalik didasarkan pada kehidrofoban dan lifofilitas. Fase stasioner terdiri dari kolom yang berbasis rantai n-alkil yang terikat secara kovalen. Sebagai contoh, C-8 dapat menandakan sebuah rantai oktil dan C-18 menandakan ligan oktadesil dalam matriks. Semakin hidrofob matriks pada masing-masing ligan, semakin besar kecenderungan kolom untuk mempertahankan gugus-gugus hidrofob. Sehingga senyawa-senyawa hidrofil terelusi lebih cepat dibanding senyawa-senyawa hidrofob.
Prinsip kerja Pertukaran Ion didasarkan pada pertukaran ion secara selektif dalam sampel dengan ion sebanding di fase stasioner. Pertukaran Ion dilakukan dengan kolom-kolom yang mengandung gugus fungsional bermuatan yang terikat pada sebuah matriks polimer. Ion-ion fungsional terikat permaen dengan kolom dan masing-masing memiliki ion sebanding yang terikat. Sampel dipertahankan dengan mengganti ion-ion sebandng dari fase stasioner dengan ion-ionnya sendiri. Sampel dielusi dari kolom dengan mengubah sifat-sifat fase gerak sehingga fase gerak akan menggeser ion-ion sampel dari fase stasioner (yaitu dengan mengubah pH).
Prinsip kerja Afinitas didasarkan pada biokimia terimobilisasi yang memiliki afinitas spesifik terhadap senyawa yang diinginkan. Pemisahan terjadi pada saat fase gerak dan sampel melewati fase stasioner. Senyawa sampel atau senyawa yang target dipertahankan sebagai sisa zat pengotor dan fase gerak lewat. Senyawa-senyawa kemudian dielusi dengan mengubah kondisi-kondisi fase gerak.
Pompa-Pompa HPLC
Ada beberapa tipe pompa yang tersedia untuk digunakan dalam analisis HPLC, yaitu: Pompa Piston Berbalas, Pompa Tipe Semprot, dan Pompa Tekanan Konstan.
Pompa Piston Berbalas terdiri dari sebuah piston yang dikendalikan oleh sebuah motor kecil, yang bergerak cepat ke depan dan ke belakang dalam sebuah bilik hidrolik yang bisa bervariasi volumenya mulai dari 35 – 400 μL. Pada gerakan ke belakang, katup kolom pemisah tertutup, dan piston menarik pelarut dari waduk fase gerak. Pada gerakan ke depan, pompa menekan pelarut keluar dari kolom dari waduk. Banyak laju aliran yang bisa dipertahankan dengan mengubah volume gerakan piston selama masing-masing siklus, atau dengan mengubah frekuensi gerakan. Pompa dengan kepala dua atau tiga terdiri dari unit-unit ruang piston identik yang beroperasi pada 180 atau 120 derajat dari fase. Tipe sistem pompa ini jauh lebih halus karena salah satu pompa sedang terisi sedang yang lainnya kosong.
Pompa Tipe Semprot paling cocok untuk kolom-kolom yang berlubang karena pompa ini hanya menyalurkan volume fase gerak tertentu sebelum harus diisi ulang. Pompa-pompa ini memiliki volume antara 250 hingga 500 mL. Pompa beroperasi dengan sekrup motor yang menyalurka fase gerak ke kolom dengan laju konstan. Laju penyaluran pelarut dikendalikan dengan mengubah tegangan pada motor.
Pada Pompa Tekanan Konstan fase gerak disalurkan melalui kolom dengan menggunakan tekanan dari sebuah silinder gas. Sebuah sumber gas bertekanan rendah diperlukan untuk menghasilkan tekanan cair yang tinggi. Tatanan pengatupan memungkinkan pengisian ulang ruang pelarut dengan cepat yang memiliki kapasias sekitar 70 mL. Ini memberikan laju aliran fase gerak yang kontinyu.
Injektor untuk HPLC
Sampel-sampel diinjeksikan ke dalam HPLC melalui sebuah lubang injeksi. Lubang injeksi ini biasanya terdiri dari sebuah katup injeksi dan loop sampel. Sampel biasanya dilarutkan dalam fase gerak sebelum injeksi ke dalam loop sampel. Sampel kemudian dimasukkan ke dalam sebuah semprot dan diinjeksikan ke dalam loop melalui katup injeksi.
Pemutaran rotor katup akan menutup katup dan membuka loop untuk menginjeksikan sampel ke dalam aliran fase gerak. Volume katup bisa berkisar antara 10 μl sampai lebih dari 500 μl. Pada sistem HPLC modern, injeksi sampel biasanya otomatis.
Injeksi stopped-flow merupakan sebuah metode dimana pemompaan dihentikan sehingga memungkinkan lubang injeksi mendapatkan tekanan atmosfir. Pipa semprot yang mengandung sampel kemudian diinjeksikan ke dalam katup dengan cara biasa, aliran dalam kolom bisa dijadikan nol dan dengan cepat dilanjutkan dengan mengalihkan fase gerak menggunakan katup tiga-arah yang terdapat di depan injektor. Metode ini bisa digunakan sampai pada tekanan yang sangat tinggi.
Kolom
Detektor dan Batas Deteksi
Detektor untuk sebuah HPLC adalah komponen yang mengemisikan sebuah respon akibat senyawa sampel yang terelusi dan selajutnya memberi sinyal sebuah puncak pada kromatogram. Detektor ini terletak tepat dibelakang fase stasioner untuk mendeteksi senyawa-senyawa pada saat terelusi dari kolom. Luas-bidang dan tinggi puncak biasanya bisa disesuaikan dengan menggunakan kontrol tuning yang kasar dan halus, dan parameter deteksi dan kesensitifan juga bisa dikontrol (pada kebanyakan kasus). Ada banyak tipe detektor yang bisa digunakan dengan HPLC. Beberapa detektor yang umum antara lain: Indeks Refraksi (RI), Utlra-Violet (UV), Fluorescent, Radiokimia, Elektrokimia, Mendekati-Infra Merah (Near-MS), Spektroskopi Massa (MS), NMR, dan Penghamburan Cahaya (LS).
C. KESIMPULAN
Instrumen-instrumen HPLC terdiri dari sebuah waduk fase gerak, sebuah fase stasioner, sebuah pompa, sebuah injektor, sebuah kolom pemisah, dan sebuah detektor. Tipe-tipe fase gerak adalah isokratis, gradien, dan polytyptic. Beberapa dari fase stasioner yang umum antara lain: Kolom Pelindung, Kolom Pengurai, Kolom Kapiler, Kolom Cepat, dan Kolom Pemisah. Beberapa dari detektor yang umum antara lain: detektor untuk Indeks Refraktif (RI), Ultra-Violet (UV), Fluorescent, dll.
No comments:
Post a Comment