Sitotoksisitas Fasciculatin dan Daya Hambatnya Terhadap Perkembangan Limfosit. Sebuah Furanosesterpen Linear Yang Diisolasi dari Ircinia viariabilis Di Pantai Atlantik Maroko

Abstrak

Fasciculatin, yang merupakan sebuah furanosesterpen yang diisolasi dari sponge laut Ircinia variabilis di Pantai Atlantik Maroko, telah dievaluasi pengaruhnya terhadap perkembangan limfosit manusia yang diinduksi mitogen dan pertumbuhan sel tumor manusia.

Kata kunci : Porifera, Ircinia variabilis, sitotoksistas, sel tumor manusia, penghambatan perkembangan limfosit.

Pendahuluan

Sesterterpen linear yang mengandung furanyl dan asam tetronat merupakan karakteristik dari berbagai metabolit yang diisolasi dari sponge laut khususnya genus Ircinia, Sacrotragus, dan Psammocinia. Jenis-jenis furanosesterterpen ini telah terbukti memiliki banyak aktivitas biologis antara lain aktivitas antivirus, antibakteri, anti-inflammatory, antitumor, dan aktivitas penghambatan protein fosfatase.
   
Pada penelitian tentang metabolit-metabolit sekunder biokatif kali ini yang berasal dari berbagai organisme laut yang diperoleh dari Pantai Atlantik Maroko, kami telah berhasil mengisolasi fasciculatin (senyawa 1) dari ekstrak klorofom sponge laut Ircinia variabilisi, yang diambil dari pantai Atlantik Maroko. Kami juga telah mengamati efek senyawa ini pada respon mitogenik limfosit-limfosit manusia terhadap terhadap phytohemagglutinin (PHA) serta efeknya terhadap pertumbuhan sel-sel tumor manusia: MCF-7 (payudara), NCI-H640 (paru-paru) dan SF-268 (Sistem Saraf Pusat).


Hasil dan Pembahasan
   
Fasciculatin (senyawa 1) pertama kali diisolasi dari sponge laut Ircinia fasciculata, yang diambil dari Pantai Naples dan selanjutnya, bersama dengan palinurin, diisolasi dari Ircinia variabilis yang diambil dari Laut Mediteranian. Akan tetapi, belum ada laporan tentang aktivitas biologisnya.
   
Identitas fasciculatin (senyawa 1) dikuatkan dengan perbandingan spektrum 13C NMR serta rotasinya dengan yang dilaporkan sebelumnya. Penentuan spektra 1H dan 13C NMR secara lengkap dicapai melalui penggunaan spektroskopi COSY, HSQC, HMBC dan NOESY. Nilai pergeseran kimia dari C-20 dan C-21 menguatkan bahwa konfigurasi  C-20, ikatan rangkap 21 adalah Z. Spektrum NOESY menunjukkan puncak-puncak silang antara H-11 (δ 6.10 dd, J = 15,0, 10,7) dan CH3-9 (1,655d, J=0,9) serta antara H-10 (5,70 d, J=10,8) dan H-7 (1,99t, J=7,4). H-12 (5.3 dd, J=15,0, 7,9) sehingga menguatkan konfigurasi E dari C-13 dan C-18.
   
Pengaruh fasciculatin terhadap pertumbuhan sel-sel MCF-7, NCI-H460 dan SF-268 secara in vitro dievaluasi setelah paparan kontinyu selama 48 jam. Hasil menunjukkan bahwa fasciculatin menunjukkan efek penghambatan pertumbuhan yang tergantung dosis yang ekivalen potensinya terhadap ketiga sel yang diteliti (Tabel 1). Akan tetapi, tidak ada aktivitas yang dideteksi pada proliferasi limfosit manusia yang diinduksi oleh PHA. Tidak adanya efek antiprolferatif terhadap limfosit darah perifer normal pada konsentrasi yang dapat menghambat pertumbuhan sel tumor bisa menjadi sifat sensitifitas spesifik tumor dari senyawa ini.

Kesimpulan
   
Fasciculatin merupakan metabolit sekunder utama dari sponge laut Ircinia variablis, yang diambil dari pantai Atlantik Maroko. Seperti halnya kebanyakan sesterterpen lain yang diisolasi dari sponge laut, fasciculatin menunjukkan sitotoksisitas sedang dan tidak ada selektifitas terhadap tiga sel kanker yang diuji. Walaupun aktivitas immunomodulatory dari fasciculatin belum pernah diamati, namun kami telah menemukan bahwa fasciculatin tidak aktif terhadap perkembangan limfosit manusia.

Prosedur Penelitian

Prosedur umum
   
Spektra 1H dan 13C NMR direkam pada suhu lingkungan di sebuah instrumen Bruker AMC yang beroperasi pada 300,13 dan 75,47 Mhz, masing-masing. Rotasi ditentukan pada sebuah instrumen Polx-2. Spektra HRMS diperoleh dengan menggunakan ionisasi +FAB dengan gas Xe pada 6 kV pada sebuah spektrometer Kratos Concept II 2 sektor. Silika gel untuk kromatografi kolom adalah Si Gel (0,2-0,5 mm Merck), untuk TLC Si Gel G-60 254 Merck analitik dan preparatif.
Bahan 
   
Sponge laut Ircinia variabilis (Pallas, 1766), diambil pada bulat Maret 2003 di litoral Atlantik kota El-Jadida, Maroko. Sponge ini diidentifikasi oleh Dr. Rob van Soet, Institut Biodiversitas dan Ecosystem Dynamics, University of Amsterdam. Sebuah contoh spesimen (ZMA Por. 17787) disimpan di koleksi Zoological Museum Amsterdam. Bahan yang dikumpulkan langsung dibekukan pada suhu -20oC selama satu malam sebelum ekstraksi.

Ekstraksi dan isolasi konstituen
   
Sampel (720 g bobot basah) dicairkan, dihomogenisasi dengan aseton (500 mL), dibiarkan pada sebuah kamar gelap selama 24 jam dan selanjutnya disaring. Residu kertas saring diekstrak kembal dengan aseton (3 x 500 mL). Ekstrak aseton cair digabungkan, diuapkan pada tekanan yang berkurang sampai volume akhir cairan adalah ca. 100 mL dan kemudan diekstraksi dengan CHCl3 (3 x 100 mL). Ekstrak CHCl3digabungkan dan dipekatkan pada tekanan yang berkurang untuk memberikan sebuah ekstrak CHCl3 mentah yang kental (7,5 g) yang diaplikaskan pada sebuah kolom silika gel 60 (70 g) dan dielusi dengan petrol-CHCl3 dan CHCl3 – aseton, 250 mL frs dikumpulkan sebagai berikut: frs 1-64 (petrol – CHCl3, 1:1), 65-95 (petrol – CHCl3, 9:1), 96-141 (CHCl3 – aseton 9:1), 142-170 (CHCl3,-aseton 4:1). Rasio menunjuk pada v/v.
   
Fraksi 3 dan 4 (1,56 g) digabungkan, diaplikasikan pada Silika gel 60 (15 g) dan dielusi dengan petrol-CHCl3, 200 mL subfrs yang dikumpulkan sebagai berikut: subfrs 1-5 (petrol-CHCl3, 7:3), 6-9 (petrol-CHCl3, 1:1), 10-15 (petrol-CHCl3, 3:7). Pemurnian subfrs 5-9 (265 mg) dengan TLC (Si gel, CHCl3-aseton-HCO2H, 98:2:0,1) yang menghailkan 174 mg fasciculatin (senyawa 1) yang diidentifikasi dengan HRMS. Pengukuran 1H dan 13C NMR (1H, 13C, DEPT, COSY, HSOC, HMBC dan NOESY) serta perbandingan rotasi spesifiknya dengan yang dilaporkan dalam literatur.

Aktivitas biologis

Bahan dan Metode
   
Sebuah stok larutan fasciculatin (senyawa 1) dibuat pada DMSO (Sigma Chemical Co) pada 400 kali konsentrasi uji maksimum akhir yang diperlukan dan disimpan pada suhu -20oC. Sampel yang dibekukan diencerkan dengan medium kultur sel tepat sebelum pengujian dilakukan. Konsentrasi akhir DMSO (≤25%) tidak mengganggu aktivitas biologis yang diuji.
Pengujian pertumbuhan sel tumor
   
Pengaruh fasciculatin terhadap pertumbuhan sel tumor dievaluasi menurut prosedur yang diadopsi oleh National Cancer Institut (NCI, Bathesda, U.S.A) dalam screen penemuan obat antikanker secara in vitro yang menggunakan zat warna pengikat protein yaitu sulforhodamine B (SRB, Sigma Chemical Co) untuk menilai pertumbuhan sel. Tiga sel tumor manusia digunakan, yaitu MCF-7 (adenokarsinoma payudara), NCI-H460 (kanker paru-paru sel non-small) dan SF-268 (kanker sistem saraf pusat). Sel-sel dipertahankan secara rutin sebagai kultur sel adherent pada medium RPMI-1640 (Gibco BRL) yang disupplementasi dengan serum darah anak sapi 5% yang dinonaktifkan dengan panas (Gibco BRL), 2 mM glutamin (Sigma Chemical Co) dan 50 μg/ml gentamicin (sigma Chemical Co) pada 37oC pada sebuah udarah lembab yang mengandung 5% CO2. Periode eksperimental sama dengan yang dipublikasikan sebelumnya dan masing-masing 1,5x105 sel/mL terhadap MCF-6 dan SF-268 dan 7,5 x 104 sel/mL untuk NCI-H460. Sel-sel pada plat 96-wadah dibiarkan bersentuhan selama satu malam dan kemudian diekspos selama 48 jam terhadap lima konsentrasi fasciculatin. Setelah periode inkubasi ini, sel-sel yang melekat ditetapkan secara in situ, dicuci dan dikeringkan dengan SRB. Stain yang terikat dilarutkan dan absorbansi diukur pada 492 nm pada sebuah pembaca plat (EAR 400. STL-Labinstruments). Sebuah kurva dosis-respon dihasilkan dan penghambatan pertumbuhan 50% (GI50), yang sesuai dengan konsentrasi fasciculatin yang menghambat 50% pertumbuhan sel bersih, dihitung sebagaimana yang telah disebutkan. Doxorubicin (Sigma Chemical Co) menggunakan sebuah kontrol positif yang diuji dengan cara yang sama.
Pengujian perkembangan limfosit.
   
Pengaruh fasciculatin terhadap perkembangan limfosit manusia dipengaruhi oleh mitogen PHA (10 μg/ml, Sigma Chemical Co) dievaluasi dengan menggunakan sebuah pengujian MTT kolorimetri yang dimodifikasi sebagaimana yang telah dijelaskan sebelumnya. Sel-sel mono-inti manusia diisolasi dari daerah perifer sukarelawan sehat yang telah diheparinisasi dengan sentrifugasi kepadatan Histopaque-1077 (Sigma Chemical Co). Sel-sel monointi manusia disesuaikan dengan 2-3 x 106 sel/ml pada medium RPMI-1640 dengan FBS 10% yang dinonaktifkan dengan panas, 2 mM glutamin dan 50 μg gentamicin. Pada sebuah plat 96-wadah yang berdasar datar, sel-sel mono-inti manusia dibiarkan berkembang dengan adanya 7 konsentrasi fasciculatin selama 4 hari pada suhu 37oC pada sebuah udara lembab yang mengandung 5% CO2. Setelah masa inkubasi ini, larutan MTT (1 mg/ml, Sigma Chemical Co) ditambahkan. Setelah 4 jam masa inkubasi, produk MTT formazan dilarutkan dengan larutan SDS/DMF (20% SDS pada sebuah larutan DMF 50%, pH 4,7) selama satu malam pada suhu 37oC. Absorbansi larutan berwarna diukur pada 500 nm pada sebuah pembaca plat (EAR 400, STL-Labinstruments).