POLYPRENYL-HYDROQUINON DAN POLYFRENYL-FURAN DARI TIGA SPONGES LAUT DAPAT MENGHAMBAT CDC25A POSFATASE YANG MEREGULASI SIKLUS SEL

ABSTRAK

CDC25 posfatase meregulasi siklus pembelahan sel dengan cara mengendalikan aktivitas kinase yang tergantung cyclin. Ketika melakukan screening untuk berbagai inhibitor posfatase pada beberapa produk alam, kami seringkali menemukan bahwa beberapa polyfrenyl-hydroquinon dan polyfrenyl-furan (furanoterpenoid) (furospongins, furospinosulin) dapat menjadi inhibitor CDC25 posfatase yang potensial. Senyawa-senyawa ini diekstrak, diisolasi dan diidentifikasi secara independen dari tiga spesies sponge (Spongia officinalis, Ircinia spinulosa, Ircinia muscarum), diambil dari lokasi-lokasi yang berbeda di Laut Mediteranian. Senyawa-senyawa ini tidak aktif pada Ser/Thr posfatase PP2C-α dan pada tiga kinase (CDK1, CDK5, GSK-3), sehingga menunjukkan bahwa beberapa CDC25 posfatase yang potensial dan selektif bisa dirancang dari struktur-struktur awal senyawa ini.

Kata kunci : polyfrenyl-hydroquinon; polyfrenyl-furan; kinase yang tergantung cyclin.


PENDAHULUAN

Posforilasi protein kemungkinan menjadi mekanisme pasca-translasi yang paling umum digunakan oleh sel untuk meregulasi fungsi-fungsi proteinnya. Status posforilasi dari sebuah protein adalah hasil dari sebuah keseimbangan antara aktivitas protein kinase (posforilasi) dan protein fosfatase (deposforilasi). Gangguan pada posforilasi protein diamati hampir pada semua penyakit manusia, sehingga menyebabkan meningkatnya penggunaan protein kinase, dan beberapa protein fosfatase, sebagai target farmakologi.

Kinase yang tergantung cyclin (CDK), yang merupakan sebuah family dari kinase yang diaktivasi oleh cyclin, memegang sebuah peranan penting dalam regulasi proliferasi sel, fungsi neuronal dan transkripsi. Semakin banyak data yang mendukung pentingnya deregulasi CDK pada perkembangan tumor manusia dan pada penyakit-penyakit neurodegeneratif. CDC25 fosfatase adalah regulator langsung dari CDK pada saat mereka mendeposforilasi dua residu penghambatan kunci (yaitu threonin dan tyrosin) yang terdapat pada poket pengikat-DNA dari subunit katalis CDK. Ada tiga isoform CDC25 yang sangat terkait pada manusia, yaitu: CDC25A terlibat dalam transisi G1/S siklus sel, CDC25B dianggap terlibat dalam fase G2, dan CDC25C terlibat dalam transisi G2/M. CDC25 dideregulasi dalam tumor-tumor manusia, kenampakan yang berlebihan terkait dengan prognosis yang buruk, CDC25A dan B memiliki sifat-sifat onkogenik. Lebih lanjut, CDC25A dan B menjadi aktif pada neuron postmitotik pada penyakit Alzheimer, sehingga menunjukkan bahwa regulasinya yang tidak normal bisa terlibat dalam perkembangan penyakit neuro-degeneratif ini. Transkripsi CDC25 distiulasi oleh protein E7 papillomavirus manusia. Pengamatan-pengamatan ini, bersama dengan fungsi-fungsi esensial dari isoform CDC25 dalam kontrol sel, membenarkan family dari fosfatase spesifitas-ganda ini sebagai target screening untuk pengidentifikasian agen-agen farmakologi baru. Beberapa inhibitor CDC25 posfatase telah ditemukan. Penggunaan struktur kristal CDC25A dan CDC25B yang baru-baru ini ditemukan bisa membantu mengubah inhibitor-inhibitor pertama ini menjadi inhibitor generasi kedua.

Sponge laut merupakan sumber melimpah dari metabolit-metabolit sekunder yang memiliki struktur unik dan aktivitas biologis yang menarik. Ketika melakukan screening untuk berbagai inhibitor CDC25A pada berbagai produk alami dari berbagai sumber independen, kami berulang kali menemukan beberapa polyfrenyl-hidroquinon dan polyfrenyl-furan yang dapat menjadi inhibitor CDC25 posfatase yang potensial. Senyawa-senyawa ini diisolasi dan diidentifikasi secara independen dari tiga spesies sponges yang diambil dari tiga lokasi berbeda di Laut Mediteranian.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Dalam penelitian ini digunakan CDC25 fosfatase sebagai sebuah target enzimatis dalam screening, yang dirancang untuk mengidentifikasi inhibitor yang berbobot molekul rendah. Selama screening ini, kami mendeteksi beberapa molekul penghambatan pada saat meneliti produk-produk alami yang diekstrak dari berbagai sponge laut (Tabel I dan Gbr. 1). Kebanyakan dari senyawa ini sebelumya telah dilaporkan.

CDC25 fosfatase diuji dengan berbagai konsentrasi dari masing-masing senyawa yang dilarutkan dalam DMSO, seperti yang telah dijelaskan sebelumnya. Nilai IC50 dihitung dari kurva-kurva dosis-respon utnuk senyawa-senyawa yang menunjukkan lebih dari 50% inhibisi pada 100 μM (data tidak ditunjukkan), sehingga menunjukkan beberapa spesifitas terhadap family CDC25 fosfatase. Tak satupun dari senyawa-senyawa ini yang ditemukan dapat menghambat CDK1/cyclin B, CDK5/p25 dan GSK-3α/β kinase pada konsentrasi 10 μM (data tidak ditunjukkan).

Karena jumlah senyawa yang terbatas, maka kesimpulan yang terbatas pula bisa ditarik berdasarkan hubungan antara struktur dan aktivitas. Pertama, sebuah struktur cincin diperlukan. Kedua, sebuah gugus fungsi asam pada cincin terlihat memberikan kontribusi bagi efisiensi senyawa. Ketiga, panjang rantai samping prenyl cukup penting, dimana aktivitas maksimal terkait dengan empat unit prenyl. Jadi jelas, lebih banyak analog yang perlu diuji sebelum kesimpulan yang pasti bisa ditarik.

Polyfrenyl hydroquinon telah ditemukan banyak bioaktivitasnya, termasuk sifat-sifat antioksidan, inhibisi posfolipase A2, lipoksigenase, HIV traksriptase terbalik, aktivitas sitotoksik antibakteri atau efek antifouling dan antifeedant. Polyfrenyl-hydroquinon dan polyfrenyl-furan saat ini merupakan struktur-struktur baru yang utama untuk penghambatan CDC25A. Mekanisme aksinya hanya bisa diperkirakan. Untuk hidroquinon, senyawa ini bisa terikat secara kovalen dengan gugus -SH yang terletak pada sisi aktif enzim, sebagaimana yang baru-baru ini ditemukan untuk sesquiterpen benzoquinon, avarone.

PROSEDUR PENELITIAN

Pengumpulan Sponges

Sampel-sampel Ircinia spinulosa dan Spongia officinalis dikumpulkan oleh para penyelam pada kedalam sekitar 3 m di Bodrum, Turki, juga pada kedalaman sekitar 15 m di pantai Naples, Italia, dan dikumpulkan dengan tangan pada kedalaman sekitar 3 m di Sutomiscica, Zadar, Kroasia. Sponges yang diambil dari Italia dan Kroasia dibekukan pada suhu -20oC sampai ekstraksi. Sampel-sampel Ircinia muscarum dikumpulkan oleh penyelam di Columbretes, Baleares, Spanyol dan langsung dibekukan. Sebuah contoh spesimen disimpan di PharmaMar S.A.

Ekstraksi dan Isolasi Senyawa

Sponges yang dibekukan (90 dan 100 g berat kering setelah ekstraksi, dari Italia dan Kroasia, masing-masing) diekstrak dengan aseton dan setelah membuang pelarut secara in vacuo, residu cairan diekstrak dengan dietil eter dan kemudian dengan n-butanol. Dietil eter diuapkan secara in vacuo untuk memberoleh minyak yang berwarna coklat (3 dan 4,9 g, masing-masing), yang diaplikasikan pada sebuah kolom silika gel. Kolom ini dielusi dengan sebuah gradien pelarut mulai dari petroleum eter (40-70oC) sampai dietil eter dan kemudian dengan kloroform-metanol (9:1). Dari sponges tersebut, yang diambil dari Italia, dihasilkan sebuah campuran senyawa 14-16 (600 mg) yang yang selanjutnya dianalisis dengan HPLC preparatif untuk memperoleh senyawa 14 murni (60 mg), 15 (320 mg), dan 16 (180 mg). Dari sponge yang diambil dari kroasia, ada tiga fraksi yang diperoleh. Fraksi yang kurang polar merupakan sebuah campuran antara senyawa 14-16, sedangkan senyawa 17 (210 mg) direcovery pada fraksi kedua. Fraksi ketiga dianalisis dengan HPLC prepratif, menghasilkan campuran Senyawa 9 (250 mg) dan Senyawa 18 murni (660 mg). Pengidentifikasian Senyawan 9, 14-18 dicapai dengan perbandingan data spektra nya (UV, IR, MS, NMR) dengan yang telah dilaporkan sebelulmnya.

Sampel-sampel segar dari spesies sponges (I. Spinulosa dan S. officinalis, 255 dan 360 g, masing-masing) diiris-iris dengan dan diekstrak secara terpisah dengan etanol (1L x 3) pada suhu kamar. Ekstrak-ekstrak yang masih mengandung etanol diaupkan secara in vacuo dan dibagi antara etil asetat (1L x 2) dan air (1L x 2), secara terpisah. Lapisan etil asetat digunakan dalam pemisahan senyawa 1-4. Rincian proses isolasi telah disebutkan sebelumnya.

I. muscarum yang dibekukan (500 g, bobot kering) diekstrak sampai habis melalui homogenisasi dengan Me2CO dengan sebuah blender pada suhu kamar. Ekstrak disaring dan kemudian dipekatkan. Residu cair yang berminyak disekat terhadap Et2O. Fraksi yang larut dalam Et2O dipekatkan secara in vacuo untuk menghasilkan minyak coklat (8,5 g) yang dipisahkan dengan kromatografi cair-vakum fase-normal (elusi gradien secara perlahan dari heksan ke Ch2Cl2 ke EtOAc ke MeOH). Sebuah fraksi utama (5,6 g) yang mengelusi dengan Ch2Cl2 dikromatografi ulang pada gel Si (gradien CHCl3-MeOH) dan lebih lanjut dimurnikan dengan kromatografi flash fase terbalik (MeOH-H2O (:1) untuk menghasilkan senyawa 13 yang telah diketahui (2 g) dan 12 (1 g). Sebuah fraksi kecil (830 mg) yang mengelusi dengan CH2Cl2-EtOAc 1:1 dari kromatografi awal lebih lanjut dimurnikan pada silika gel dengan menggunakan sebuah gradien CHCl3-MeOH, diikuti dengan kromatografi flash fase-terbalik (MeOH-H2O (:1) untuk menghasilkan senyawa 7 (4 mg). Semua produk dipisahkan dengan sistem HPLC analitik yang terdiri dari catridge ppack radial fase-terbalik C18 (10 μ) yang dielusi dengan campuran MeOH-H2O 95:5 pada 1,5 mL/menit; senyawa 13 (tR 3,30 menit, λ 294 nm), senyawa 12 (tR 3,60 menit, λ 258 nm) dan senyawa 7 (tR 3,66 menit, λ 279 nm). Senyawa 12 dan 13 juga diasetilasi. 30 mg dari masing-masing senyawa dilarutkan dalam 1 mL pyridin dan 2 mL anhydrida asetat dan perlahan ditambahkan ke dalam larutan. Setelah pengadukan 24 jam pada suhu kamar, 10 mL air es ditambahkan dan produk-produk diekstrak dengan EtOAc. Residu dimurnikan dengan kromatografi kolom pada silika gel dengan n-heksan-EtOAc 9:1 untnuk menghasilkan senyawa 11 dab 10, masing-masing.

Penentuan Struktur

Spektra 1H-NMR dan 13C-NMR dari senyawa-senyawa dicatat pada sebuah spektrometer JEOL α500 (500 Mhz) FT NMR. Semua spektra diambil pada CDCl3. Salah satu konektifitas 1H-13C heteronuklir ikatan ditentukan dengan eksperimen-eksperimen 2D HMQC. Spektra EIMS dilakukan pada sebuah instrumen Hitachi M-2500. Pengukuran IR dilakukan pada sebuah spektrometer inframerah Hitachi 260-10 pada Ccl4. Penentuan struktur dilakukan dengan interpretasi data spektra dan struktur senyawa yang telah diketahui juga dibandingkan dengan yang dilaporkan dalam literatur (Tabel III dan IV).
Reagen-Reagen Biokimia

Sodium orto-vanadate, EGTA, EDTA, RNAse A, Mops, sodium fluoride, glutathion-agarose, dithiothreitol (DTT), p-nitrofenilposfatase, ampicilin, IPTG, Nonidet-P40, leupeptin, aprotinin, inhibitor trypsin kedelai, bezamidin, glutathion, manik glutathion-agarose, casein terdeposforilase diperoleh dari perusahaan Sigma Chemicals.
Preparasi CDC25 Posfatase dan Pengujiannya

CDC25A manusia rekombinan diperoleh, dimurnikan dan diuji sebagaimana disebutkan dan diringkas sebagai berikut.
Pertumbuhan bakteri dan induksi protein fusi. Sebuah turunan Escherichia coli yang ditransformasi dengan sebuah plasmid yang mengkodekan pembentuk fusi gen dari glutathion-S-transferase (GST) dan CDC25A manusia. Bakteri pertama-tama ditumbuhkan selama satu malam pada suhu 37oC dengan adanya 100 μg/mL ampicillin dalam medium LB. 4 mL dari pra-kultur ini diinokulasi per liter LB yang mengnadung 100 μg/mL ampicillin. Inkubasi dilanjutkan pada suhu 30oC sampai kultur O.D. Pada 600 nm dapat mencapai 0,8-1. Pada saat ini, 0,4 mM IPTG ditambahkan dan kultur diinkubasi pada 25oC selama sekurang-kurangnya 7 jam (GST-CDC25A). Sel-sel kemudian dipanen dengan sentrifugasi 3000 g selama 15 menit pada suhu 4oC. Butiran-butiran disimpan dan dibekukan pada suhu -80oC sampai dilakukan ekstraksi.
Pemurnian protein fusi. Butiran bakteri dihomogenisasi dengan sonikasi pada suhu 4oC dalam buffer lysis (1% Nonidet-P40, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10 μg/mL leupeptin, 10 μg/mL aprotinin, 10 μg/mL inhibitor trypsin kedelain, 100mM benzamidin dalam larutan garam yang berbuffer posfaat). Homogenat disentrifugasi pada 100.000 g selama 30 menit pada suhu 4oC dan supernatan disimpan dalam aliquot 10 mL pada suhu -80oC. Protein-protein fusi dimurnikan dengan kromatografi afinitas pada alas glutation-agarose. 10 mL ekstrak bakteri diinkubasi dengan 400 μL GSH (disetimbangkan dalam buffer lysis) selama 30 menit pada suhu 4oC dengan rotasi konstan. Bead/manik dicuci empat kali dengan 10 mL buffer lysis, diikuti dengan empat pencucian dengan 10 mL buffer Trus B (50 mM Trus, pH 8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM DTT). Protein-protein fusi dielusi dengan inkubasi dengan 4 x 1 mL 20 mM glutathion dalam buffer Tris B. Efisiensi elusi dipantau dengan sebuah pengujian posfatase dan dengan SDS-PAGE. Bead/manik GSH disiklus ulang melalui pencucian dengan 1 M NaCl diikuti dengan ekuilibrasi pada buffer lysis.

Pengujian aktivitas GST-CDC25A posfatase. Pengujian dilakukan pada plat-plat mikrotitrasi seperti yang telah dijelaskan sebelumnya: 20 μL GST-CDC25A ditambahkan ke dalam 20 μL dari 10 mM DTT pada Tris buffer A (50 mM Tris, pH 8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) dan 140 μL dari Tris buffer A. Plat-plat dipra-inkubasi pada 37oC selama 15 menit dalam sebuah inkubator mikroplat Denley Wellwarm 1. Reaksi-reaksi dimulai dengan penambahan 20 μL p-nitrofenilposfatase 500mM pada Tris buffer A. Setelah 30 menit inkubasi pada suhu 37oC, absorbansi pada 405 nm diukur pada sebuah pembaca mikroplat Biorad.

Pengujian Protein Posfatase 2C

Aktivitas protein posfatase rekombinan 2C-α (PP2C) ditentukan dengan mengukur pelepasan 32P dari casein radiasi. Sebagian casein yang terdeposforilasi diposforilasi dengan menggunakan protein kinase yang tergantung cAMP sebagaimana yang telah dijelaskan sebelumnya. Casein yang berlabel [32P] didialisis terhadap 4 L NaCl 100mM, 0,1 mM EGTA dan 20 mM Tris-HCl, pH 7,5 (2 perubahan). Untuk menonaktifkan setiap kinase yang tersisa, sampel casein yang berlabel dipanaskan pada suhu 60oC selama 10 menit. Aktivitas PP2C diuji dengan casein berlabel 32P pada suhu 30oC pada sebuah reaksi yang mengandung 1 ng substrat dengan volume total 30 μL. Reaksi-reaksi posfatase dimulai dengan penambahan substrat dan dihentikan dengan penambahan 200 μL asam trikloroasetat 50%. Sampel-sampel kemudian diinkubasi pada es selama 30 menit dan disentrifugasi pada 10.000 g selama 10 menit pada suhu 4oC. Radioaktivitas dari supernatan ditentukan dengan pengukuran radiasi Cerenkov. Pengujian CDK1/cyclin B dan GSK-3 dilakukan seperti yang telah dijelaskan sebelumnya.